HPG/AHA蛋白合成分析方案熒光顯微鏡

介紹

L-高炔丙基甘氨酸（HPG）和L-疊氮高丙氨酸（AHA）是傳統35S蛋氨酸的非放射性替代品，后者在活性蛋白質(zhì)合成過(guò)程中被并入蛋白質(zhì)中，可以直接添加到細胞中。用于檢測從頭合成蛋白的基于HPG和AHA的商業(yè)試劑盒提供了很好的結果，但通常非常昂貴，并且提供了固定量的試劑，這限制了這些試劑盒的優(yōu)化或非協(xié)議使用。自組裝套件是商用套件的可行替代品，尤其是當所有組件都可從許多供應商處廣泛獲得時(shí)。試劑的量和點(diǎn)擊反應條件在許多商業(yè)試劑盒之間非常相似，并且符合大量已發(fā)表的基于HPG和AHA的新合成蛋白質(zhì)檢測程序。使用所提供的方案，研究人員將能夠組裝HPG或AHA蛋白質(zhì)合成測定，這將需要很少的微調（如果有的話(huà)）。

這些具有改進(jìn)的生物相容性和檢測極限的試劑盒首先由賽默飛世爾科學(xué)公司商業(yè)化，并以Click iT®HPG和Click i T®AHA的價(jià)格出售。Click Chemistry Tools工具包利用了下一代銅螯合疊氮化物。在疊氮化物報告分子處引入銅螯合部分允許顯著(zhù)增加反應位點(diǎn)處的有效Cu（I）濃度，增強了反應速率加速中的最弱環(huán)節，大大提高了用于分析細胞中蛋白質(zhì)合成的基于HPG和AHA的測定的靈敏度和生物相容性。

所需材料

HPG（L-炔丙基甘氨酸）或AHA（L-氮雜高丙氨酸）

AZDye吡啶疊氮化物

五水合硫酸銅（II）

THPTA公司

抗壞血酸鈉

固定劑（PBS中3.7%甲醛）

滲透試劑（例如，0.5%Triton®X-100 PBS溶液）

PBS中的3%BSA（pH 7.4）

Hoechst 33342（可選）

材料準備

HPG/AHA儲備溶液制備50 mM HPG或AHA在DMSO或水中的溶液，例如使1 mL 50 mM儲備溶液溶解8 mg HPG或9 mg AHA在1 mL DMSO中或水中

AZDye Picolyl Azide儲備溶液在DMSO或水中制備1mM溶液。示例：要制備150µL，將整個(gè)AZDye Picolyl Azide試劑盒溶于150µL DMSO或水中

銅催化劑（25 mM CuSO4，62.5 mM THPTA）溶液稱(chēng)出312 mg五水合硫酸銅（II）和1.35 g THPTA，加入50 mL水，渦旋至溶解

反應緩沖液50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5。將3.02 g Tris，4.4 g NaCl溶于500 mL水中，調節pH至7.5，無(wú)菌過(guò)濾器

Hoechst 33342 10 mg/mL儲備溶液。將1 mg Hoechst 33342溶解在100µL去離子水中

還原劑將20 mg抗壞血酸鈉溶于1.8 mL去離子水中。渦旋直至溶解?？箟难徕c溶液易被氧化。我們建議始終使用新鮮制備的抗壞血酸鈉溶液

在PBS中洗滌緩沖液0.5 mM EDTA、2 mM NaN3。向1 L PBS中加入1 mL 0.5 M EDTA和0.13 g干燥die氮化鈉。用于長(cháng)期儲存的無(wú)菌過(guò)濾器

1.用HPG/AHA標記細胞

該方案基于大量基于HPG和AHA的程序的出版物，用于分析與不同類(lèi)型細胞一起使用的細胞中的肽合成。優(yōu)化的HPG/AHA濃度為50μM，但可能需要根據給定的細胞類(lèi)型進(jìn)行調整。生長(cháng)培養基、細胞密度、細胞類(lèi)型變化和其他因素可能會(huì )影響標記。鼓勵研究人員首先確定HPG試劑的最佳濃度以及每種細胞類(lèi)型的標記時(shí)間。

將細胞以所需的密度放置在蓋玻片上，并在額外處理前讓其恢復過(guò)夜

在DMSO或水中制備50 mM HPG或AHA溶液

用PBS清洗細胞一次，加入無(wú)蛋氨酸培養基，并在37°C下孵育細胞30–60分鐘，以耗盡蛋氨酸儲備

將所需量的HPG或AHA添加到無(wú)L-蛋氨酸培養基中的細胞中，以達到最佳工作HPG/AHA濃度（50μM，如果未優(yōu)化）

在培養的細胞中加入HPG或AHA時(shí)，避免以可能破壞正常細胞循環(huán)模式的方式干擾細胞

在適合細胞類(lèi)型的條件下培養細胞所需的時(shí)間。不同的細胞類(lèi)型可能需要不同的孵育期，以便用HPG或AHA進(jìn)行最佳標記。作為起點(diǎn)，我們建議50μM HPG或AHA持續1小時(shí)

立即進(jìn)行細胞固定和滲透

2.細胞固定和滲透

以下方案用于在PBS中使用3.7%甲醛的固定步驟，然后進(jìn)行0.5%Triton®X-100滲透步驟。也可以使用使用其他固定/滲透試劑（如甲醇和皂苷）的方案。

將每個(gè)蓋玻片轉移到一個(gè)井中。為了方便加工，使用6孔板

代謝標記后，移除培養基，向每個(gè)含有蓋玻片的孔中加入1 mL PBS中的3.7%甲醛。室溫下孵育15分鐘

去除固定劑，用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個(gè)孔中的細胞兩次

取出洗滌液。向每個(gè)孔中加入1 mL 0.5%Triton®X-100 PBS溶液，然后在室溫下孵育20分鐘

3.HPG/AHA檢測

注：每個(gè)蓋玻片使用500μL反應混合物。只要剩余的反應組分保持在相同的比例，可以使用較小的體積。

根據表1制備所需量的反應雞尾酒。按表中所列順序添加配料。在制備后15分鐘內使用反應混合物。

表1

移除滲透緩沖液（步驟2.4）。用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個(gè)孔中的細胞兩次。取出洗滌液。

向每個(gè)含有蓋玻片的孔中加入0.5mL反應雞尾酒。短暫搖動(dòng)盤(pán)子，確保反應混合物均勻分布在蓋玻片上。

避光，在室溫下孵育板30分鐘

取出反應混合物。用PBS中的1mL 3%BSA洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。

用1mL洗滌緩沖液洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。

用1mL PBS洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。

此時(shí)，樣本已準備好進(jìn)行DNA染色。如果不需要DNA染色，繼續進(jìn)行成像

如果需要對樣品進(jìn)行抗體標記，請按照制造商的建議進(jìn)行標記。培養過(guò)程中，保持樣品免受光照。

4.DNA染色

用1mL PBS清洗每個(gè)孔。取出洗滌液。

通過(guò)稀釋Hoechst 33342 1:2000的儲備溶液制備1x Hoechs 33342溶液。1x Hotechst 33332溶液的最終濃度為5µg/mL。

1x Hoechst 33342的最終濃度范圍為2μg/mL至10μg/mL。

每孔添加1 mL 1x Hoechst 33342溶液。防止光線(xiàn)照射。在室溫下孵育30分鐘。

移除Hoechst 33342溶液。

用1mL PBS洗滌每個(gè)孔兩次。

取出洗滌液。

成像

標記細胞與所有載玻片制備方法兼容

所選引用：

Dieterich，D.C.、Link，A.J.、Graumann，J.、Tirrell，D.A.和Schuman，E.M.等人（2006）。使用生物正交非經(jīng)典氨基酸標記（BONCAT）選擇性鑒定哺乳動(dòng)物細胞中新合成的蛋白質(zhì)。美國國家科學(xué)院院刊，103（25），9482-87。[PNAS]