在五十年的研究歷程中,從開始研究cAMP,cGMP在各種生理過程中的調節(jié)作用,到近幾年與之相關的藥物研發(fā),藥物篩選領域,人們一直在努力尋找一種快速、靈敏、特異性和可重復地定量檢測cAMP和cGMP含量的方法。
檢測方法演變
cAMP,cGMP分子量分別只有329.21和345.21,在機體內的含量極低,為p mol/L級別,用一般的分析方法無法測定。70年代一系列測定cAMP和cGMP的方法被發(fā)明出來,最基本的原理有三種:分別是競爭性蛋白質結合分析法[3]、放射性免疫分析法[4]和薄層色譜法[5]。在80年代,放射性免疫分析法得到了廣泛的應用和改進,由于這種方法采用放射性核素標記,應用范圍受到一定限制,為了進一步提高檢測的靈敏度和操作的安全性,進入90年代又陸續(xù)發(fā)明了各種酶標記法和化學發(fā)光法的競爭性ELISA檢測試劑盒,這一類檢測方法的根本原理都是基于抗體抗原的免疫反應,所有這些試劑盒中采用的抗體全部是兔抗血清或者是經過特異親和提純之后的抗cAMP或cGMP的兔多抗,毫無疑問,兔多抗在約四十年的cAMP,cGMP定量檢測中做出了巨大貢獻,但同時它也有著明顯的缺陷:
1,兔多抗對cAMP,cGMP的特異性不高,會與其他核苷類似分子發(fā)生交叉反應,盡管可以通過特異親和提純降低交叉,但仍然無法消除交叉;
2,兔多抗對cAMP和cGMP的親和力受高濃度的二價陽離子(比如Mg2+和Ca2+)的影響;
3,兔多抗在制備的過程中存在個體差異和批間差異,難以保證檢測數據的重復性;
4,兔多抗試劑盒在cAMP,cGMP樣品的處理上也需要進行乙?;幚恚@與兔多克隆抗體制備方法有必然關系,如果不乙酰化將無法達到檢測所需的靈敏度。
所以無論標記方法如何革新,不改進抗體,仍然不能從根本上迎來cAMP,cGMP定量檢測的變革。
cAMP和cGMP單克隆抗體成功開發(fā)
NewEast Biosciences(紐斯特)公司的科學家經過兩年的研發(fā),篩選了4萬多個克隆,終于從中發(fā)現了高特異性,高親和力的cAMP和cGMP單克隆抗體。并成功構建了基于單抗的cAMP和cGMP ELISA檢測試劑盒。這個cAMP(cGMP)單抗對非乙酰化的cAMP(cGMP)的特異性識別能力是其對cGMP(cAMP)、ATP(GTP)以及其他核苷類似物識別能力的108倍以上,這相比于以往的多抗試劑盒大大提高了cAMP (cGMP) 檢測的靈敏性和特異性,并且極大的降低了試劑盒的批間差異,提供了長久有效地可重復性檢測,也擺脫了繁瑣的乙?;^程和對科研人員健康不利的乙?;瘬]發(fā)試劑。