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ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)是蛋白質(zhì)檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)"方法。1在本博客中,回顧了三種流行的 ELISA 平臺:標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA)。我們將對這些 ELISA 的設(shè)計原理、樣本量、儀器和靈敏度進行比較。
ELISA的基本設(shè)計原理取決于抗體-抗原相互作用的穩(wěn)定性和特異性。簡而言之,固定在珠子或微孔板等固體基質(zhì)上的捕獲抗體可與多種樣品類型中的目標(biāo)蛋白結(jié)合。此類樣品可包括血漿、血清、細胞和組織裂解物、條件培養(yǎng)基或尿液。
1971 年引入 ELISA 時,酶標(biāo)記抗原被纖維素顆粒上的抗體捕獲。2然后通過反復(fù)離心和洗滌分離抗體-抗原綴合物。此后,不同的 ELISA 格式被開發(fā)出來,包括夾心 ELISA,其中目標(biāo)蛋白“夾在"捕獲抗體和標(biāo)記檢測抗體之間(圖 1)。這種 ELISA 格式具有高度特異性,因為需要兩種抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合才能進行檢測。此外,可以用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定蛋白質(zhì)濃度(即定量數(shù)據(jù))。
這里討論的 ELISA 平臺——標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA) ——是生成定量數(shù)據(jù)的夾心 ELISA。然而,它們在底物、檢測方法、儀器、樣品體積和靈敏度方面有所不同。
標(biāo)準(zhǔn) ELISA (sELISA) 將捕獲抗體固定到透明塑料 96 孔微孔板上(圖 2、表 1)。該檢測抗體與辣根過氧化物酶 (HRP) 結(jié)合,該酶可將其底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 還原為藍色和氧化形式。顏色的變化與 HRP 的量成正比,并且推論與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。添加硫酸可終止 HRP-TMB 反應(yīng),導(dǎo)致顏色從藍色變?yōu)辄S色。使用酶標(biāo)儀在 450 nm 處測量吸光度。
表 1. 標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR 和單分子陣列 (SIMOA) 的比較。 * = 樣品稀釋后每次重復(fù)的最終體積。
sELISA 的靈敏度一般范圍為 1 pg/ml 至 100 pg/ml。然而,一些 sELISA 的定量限 (LLOQ) 低至亞 pg/ml 或高達 10 ng/ml。與所有 ELISA 一樣,靈敏度取決于所用抗體的靈敏度。
對于標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板,最終樣品體積為每孔 100 µL。使用“半面積"板可以減少體積 (50 µL) ,其中孔的直徑為一半寬,但測定靈敏度也可能會降低。用于任何ELISA 的原始樣品體積將取決于最佳樣品稀釋度,該稀釋度會因蛋白質(zhì)、樣品類型和實驗而異。
將樣品添加到板中后,大約 5 小時內(nèi)即可獲得結(jié)果。然而,當(dāng)樣品和抗體同時添加到板中時,可以實現(xiàn)更快的周轉(zhuǎn)時間。這減少了孵育步驟和洗滌步驟的數(shù)量。例如,SpeedELISA的處理時間為 3 小時,在添加樣品之前同時孵育板上的捕獲和檢測抗體。其他方法包括一步添加樣品和兩種抗體,或者將樣品和檢測抗體一起添加。然而,減少處理時間會降低靈敏度(圖 3)。
sELISA 的主要優(yōu)點是提供低成本試劑盒,可以針對來自多個物種的數(shù)千種不同蛋白質(zhì)。此外,sELISA 幾乎不需要培訓(xùn),可生成易于解釋的數(shù)據(jù),并使用與其他檢測兼容的經(jīng)濟實惠的酶標(biāo)儀。這些優(yōu)點導(dǎo)致 sELISA 在研究中得到廣泛使用。
免疫 PCR也稱為免疫定量 ELISA (IQELISA),將捕獲抗體粘附到塑料 96 孔 PCR 板上,同時檢測抗體與 DNA 條形碼綴合(圖 4、表 1)。使用 PCR,雙鏈 (ds) DNA 條形碼在條形碼特異性引物和與 dsDNA 結(jié)合的熒光染料存在的情況下分別被擴增和染色。熒光與 dsDNA 的量成正比,因此也與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。使用實時 PCR 儀器測量熒光。
IQELISA 的一個優(yōu)點是其體積要求小,每次重復(fù)的最終體積僅為 10 µL。因此,當(dāng)樣品量有限或難以獲得樣品時,IQELISA 是一個特別有吸引力的選擇。然而,IQELISA 比 sELISA 在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性,因為它需要更精確的移液。此外,樣品應(yīng)至少重復(fù)三次,因為小體積會增加異常值的機會。
DNA 通過 PCR 擴增循環(huán)呈指數(shù)增長。因此,與使用相同抗原和抗體對的 sELISA 相比,IQELISA 的 LLOQ 平均增加了 23 倍。靈敏度的增加取決于抗體,范圍從無變化到 105 倍(圖 5)。
從樣品孵育到數(shù)據(jù)收集,IQELISA 大約需要 5.5 小時。該周轉(zhuǎn)時間與 sELISA 類似。
SIMOA是一種超靈敏 ELISA,使用抗體包被的珠子和熒光偶聯(lián)的檢測抗體(圖 6、表 1)。將珠子、樣品和檢測抗體混合在一起后,將溶液施加到具有超過 235,000 個微孔的卡盒中。每個微孔只能容納一顆珠子。然后將油添加到卡盒中,將樣品推過微孔陣列的表面并形成孔的液密密封。
使用配備熒光顯微鏡的全自動或半自動系統(tǒng)測量熒光;該儀器由 SIMOA( Quanterix ;Billerica,MA;美國)開發(fā)商制造。由于每個孔只能包含一個珠子,因此具有熒光的微孔的數(shù)量與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。這使得單分子檢測成為可能。
SIMOA 的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是它可以檢測飛摩爾范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。也就是說,靈敏度通常在 10 fg/ml 至 1 pg/ml 范圍內(nèi)。與 sELISA 和 IQELISA 相比,SIMOA 的平均靈敏度分別提高了 465 倍和 63 倍。
將試劑裝入 Quanterix 儀器后,大約需要 3 小時才能獲取數(shù)據(jù)。因此,SIMOA 的程序時間比 sELISA 和 IQELISA 都短。
雖然 SIMOA 實現(xiàn)了此處評測的三個平臺中的一些最高靈敏度,但該技術(shù)也有一些缺點。首先,目前使用該技術(shù)分析的蛋白質(zhì)數(shù)量很少(~165)。其次,SIMOA 試劑盒的成本高于 sELISA 和 IQELISA 試劑盒。第三,檢測儀器價格昂貴,且只能用于SIMOA,是專用儀器,需要專門培訓(xùn)才能運行。
值得一提的是,IQELISA 和 SIMOA 分別可以同時分析多達 3 個和 6 個目標(biāo)。除了需要更少的樣品之外,在分析相同數(shù)量的蛋白質(zhì)時,多重檢測通常比單重檢測更具成本效益。重要的是,多重檢測會降低 IQELISA 的靈敏度,而使用SR-X TM生物標(biāo)志物檢測系統(tǒng)的SIMOA 則不會影響靈敏度。
還提供其他定量多重 ELISA 選項,包括 Quantibody® 和 RayPlex TM 抗體陣列。Quantibody可以使用 100 µL 稀釋樣品在 6 小時內(nèi)分析多達 40 種蛋白質(zhì),一式四份。使用兼容的激光掃描儀采集數(shù)據(jù)。RayPlex可以使用流式細胞術(shù)在 4 小時內(nèi)每次重復(fù)使用 25 µL 稀釋樣品測量多達 25 種蛋白質(zhì)。兩種抗體陣列的靈敏度與 sELISA 相似。
在我們的博客“使用抗體陣列進行多重蛋白質(zhì)檢測"或我們的視頻“為您的研究識別正確的抗體陣列"中了解如何確定用于多重蛋白質(zhì)檢測的正確抗體陣列。
標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR (IQELISA) 和 SIMOA 相互比較時具有優(yōu)點和缺點:
sELISA是一種簡單的比色測定法,數(shù)據(jù)易于解釋,因此幾乎不需要培訓(xùn)。使用能夠測量 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀在 5 小時內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。使用比 IQELISA 和 SIMOA 試劑盒便宜的試劑盒可以靶向數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。然而,與 IQELISA 和 SIMOA 相比,sELISA 的靈敏度低。
免疫PCR使用實時PCR儀器,在6小時內(nèi)收集數(shù)據(jù)。在此介紹的三個 ELISA 平臺中,它的體積要求低,但比 sELISA 需要更多的移液和數(shù)據(jù)分析技術(shù)專業(yè)知識。平均而言,其靈敏度比 sELISA 高 23 倍??梢酝瑫r檢測 3 種蛋白質(zhì),但檢測靈敏度會降低。
SIMOA的靈敏度最高,其靈敏度平均分別比 sELISA 和 IQELISA 提高了 465 倍和 63 倍。使用需要專門培訓(xùn)的昂貴專用儀器可在 3 小時內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。它還需要比 sELISA 和 IQELISA 更多的樣本量。一次可以分析多達 6 種蛋白質(zhì),而不會影響靈敏度。
圖 8 表明,對于許多蛋白質(zhì),LLOQ 的總體改進遵循以下趨勢:SIMOA > IQELISA > sELISA。不過,也有例外。例如,IQELISA 對人 IL-1β 的靈敏度最高,為 0.0064 pg/ml,而 sELISA 和 SIMOA 的 LLOQ 分別為 0.3 和 0.04 pg/ml。
最常見的蛋白質(zhì)檢測工具之一是 ELISA。在這里,我們比較了三種流行的夾心 ELISA 平臺:標(biāo)準(zhǔn) ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA)。在為研究選擇合適的 ELISA 時,其底物、檢測方法、儀器、樣品量、靈敏度和成本是重要的考慮因素。標(biāo)準(zhǔn) ELISA 是流行的方法,因為 可以使用低成本 試劑盒來靶向來自多個物種的數(shù)千種不同蛋白質(zhì)。此外,它幾乎不需要培訓(xùn)即可運行,其數(shù)據(jù)易于解釋,并且使用非專用 酶標(biāo)儀 與其他測定兼容。一個關(guān)鍵要點是 ELISA 靈敏度和成本之間需要權(quán)衡:靈敏度越高,成本越高。成本考慮了套件、培訓(xùn)、勞動力和所需儀器的價格。因此,sELISA 是實惠的選擇,而 SIMOA 是最敏感的。
對于不具備必要的專業(yè)知識或設(shè)備來使用此處討論的 ELISA 平臺分析樣品的實驗室,RayBiotech Life, Inc. 提供完整的測試服務(wù)。該服務(wù)提供完整的報告,包括原始數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)濃度。
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