免疫熒光染色是常用的生化檢查方法，常用于組織學中抗原或抗體的定位，也可用于體液樣本中抗原或抗體的定量檢測。很多小伙伴在做免疫熒光染色實驗時遇到了各種問題。其實，掌握了免疫熒光染色實驗的原理、操作步驟和注意事項后，順利完成一次免疫熒光染色實驗并不困難。

1.什么是免疫熒光技術？
免疫熒光技術（Immunofluence technology）又稱熒光抗體技術，主要原理是利用抗原與抗體之間的特異性結合來展示目標蛋白。免疫熒光技術不僅抗原抗體反應特異性高，而且在熒光顯微鏡下可以清晰顯示其形態(tài)，直觀性強。

免疫熒光染色實驗有兩種類型，包括直接免疫熒光和間接免疫熒光。

如何解決免疫熒光染色底色過重的問題？詳細講解實驗操作及注意事項

直接免疫熒光是最早的方法。其基本原理是用已知的抗體標記熒光素，成為特異性熒光抗體。染色時，將抗體直接滴在載玻片上孵育，使其直接與載玻片上的抗原結合，可直接在熒光顯微鏡下檢測。觀察并做出判斷。

間接免疫熒光法的基本原理是利用特異性抗體與切片中的抗原結合，然后利用間接熒光抗體與之前的抗原抗體復合物結合，形成抗原抗體熒光復合物。在熒光顯微鏡下，通過復合物的發(fā)光來確定檢測到的抗原。

兩種方法的基本原理是相同的。免疫熒光 (IF) 或細胞成像技術使用抗體將熒光染料（也稱為熒光素或熒光團）（例如異硫氰酸熒光素 (FITC)）標記到特定的目標抗原。與熒光素化學綴合的抗體廣泛用于 IF 實驗。

直接免疫熒光法簡單、特異、快速、方便，常用于腎活檢組織中多種免疫球蛋白的檢測和病原體的檢測。但其缺點是只能檢測一種相應物質，靈敏度較差，有時效果不理想。

間接免疫熒光法由于與抗原抗體復合物結合的熒光素抗體增多，熒光亮度強，因此具有較強的靈敏度。因此，間接免疫熒光法更為常用，只需制備一種熒光抗體，即可應用于多種一抗的標記展示。

2. 免疫熒光染色實驗的操作步驟
免疫熒光染色的操作步驟通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、重新洗滌和測定讀數。本文以間接免疫熒光為例，講解從固定到封固各步驟的原理。

1）樣品制備
對于貼壁細胞：可以直接使用多孔板，如6孔板、24孔板等來培養(yǎng)細胞，然后在預定的時間進行固定等后續(xù)操作。也可以使用干凈的蓋玻片，浸泡在70%乙醇中，用無菌鑷子置于6孔板中，然后用無菌鹽水、PBS或培養(yǎng)基洗去殘留的乙醇。此時即可接種細胞進行培養(yǎng)，待細胞在蓋玻片上生長良好后，即可進行固定等后續(xù)操作。

對于懸浮細胞：先用固定液固定細胞，然后將細胞滴在載玻片上，干燥后細胞會粘在載玻片上。然后就可以進行后續(xù)操作了。如果細胞粘附力較差，可以用PDL等物質處理載玻片，以增強載玻片的粘附力。

對于冷凍切片：將切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續(xù)操作。

對于石蠟切片：將切片在二甲苯中脫蠟 5 分鐘，然后用新鮮二甲苯脫蠟，并用共用二甲苯脫蠟 3 次。無水乙醇 5 分鐘，兩次。 90%乙醇5分鐘，兩次，70%乙醇5分鐘，一次。蒸餾水5分鐘，兩次。

抗原修復：根據抗原和抗體的不同，可將切片放入以下抗原修復液中，10mM檸檬酸鈉，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris，pH10.0，95℃加熱12分鐘，約30分鐘慢慢冷卻至室溫。

2）固定
目標是保留組織的原始結構，維持細胞形態(tài)和抗原的細胞分布。當組織細胞死亡時，細胞會分解，從溶酶體和其他細胞器中釋放的酶可以水解組織，這一過程稱為自溶。為了避免這種情況，有必要固定組織細胞。

細胞或切片可以用適當的固定劑固定，固定后用免疫染色洗滌液 (P0106) 洗滌兩次，每次 5 分鐘。常用的固定劑有甲醛、戊二醛、甲醇/丙酮。不同固定劑所需的時間和濃度不同，需要根據具體實驗探索。

3）膜破裂
膜破裂，使抗體有機會遇到抗原。因為免疫染色的基本原理是抗原和抗體結合，然后標記的抗體發(fā)出熒光，從而可以對目標蛋白進行定性或定量分析。如果待檢測的抗原位于細胞膜或細胞外基質的外表面，則可以省略透化步驟。因為抗體也可以有機會與抗原結合而不破膜。然而，如果要檢測的抗原位于細胞內，則需要打破細胞膜，并將細胞暴露于針對目標蛋白質的一抗，以確保抗體能夠接近表位。常用的破膜劑有Triton X-100、NP-40、Brij-58、皂苷、洋地黃皂苷、甲醇/丙酮。再次，破膜劑的選擇應根據具體實驗進行。

4) 封閉
封閉是最小化一抗非特異性結合的重要步驟。在使用特異性一抗與目的蛋白結合的過程中，如果出現非特異性結合，可能會出現假陽性結果，而且背景染色過強也會干擾目的染色的呈現，影響對結果的判斷。實驗結果。理論上，任何不結合靶抗原的蛋白質都可以用于封閉。血清是一種常見的封閉劑，因為它含有與非特異性位點結合的抗體。使用血清或蛋白封閉劑進行封閉可防止抗體與組織或 Fc 受體的非特異性結合。

從封閉開始的所有步驟，必須注意樣品的保濕，避免樣品干燥，否則容易產生高背景。

5) 一抗孵育
預選的特異性一抗可以與目的蛋白結合。這一步需要注意一抗是針對什么物種的。如果組織細胞來源是小鼠，一抗應該是某種動物抗小鼠，其中某種動物是指一抗宿主，例如一抗是山羊抗小鼠，山羊就是一抗抗體宿主。

6）二抗孵育一
抗孵育后，將未結合的一抗洗掉，即可進行一抗與二抗的結合。二抗應該是針對一抗宿主物種的熒光標記二抗。例如，一抗是山羊抗小鼠，二抗應該是某種動物抗山羊，例如兔抗山羊。

如果進行雙染，要注意一抗和二抗宿主的選擇，以免出現交叉結合的可能。例如，如果組織來源是小鼠，并且需要檢測兩種目標蛋白，則一抗宿主應不同，二抗應具有不同的熒光標記。針對目標蛋白A的一抗可以是山羊抗小鼠，針對目標蛋白B的一抗可以是大鼠抗小鼠（大鼠和山羊是不同的一抗宿主），針對A的二抗是具有綠色熒光的兔抗體山羊二抗、B二抗是兔抗大鼠二抗，有紅色熒光，這種組合是可以的。在熒光顯微鏡下，目標蛋白A被染成綠色，目標蛋白B被染成紅色。但如果B一抗也是羊抗鼠的話，A二抗也會和B一抗結合，這時候就亂了，熒光鏡下是綠色的。

7）蓋玻片
封片是指免疫染色后使用封片劑將蓋玻片粘附到組織切片或細胞涂片上。蓋玻片可保護染色樣本免受物理損壞。進行蓋玻片的封片劑也有助于提高顯微鏡下圖像的清晰度和對比度。

8) 蛋白質的檢測
對于免疫熒光染色，此時已經可以直接在熒光顯微鏡下觀察。

如何解決免疫熒光染色底色過重的問題？詳細講解實驗操作及注意事項

3. 三種細胞免疫熒光染色實驗舉例
zo-1 的免疫熒光
1) 當細胞在蓋玻片上生長至95%-100%匯合時從培養(yǎng)箱中取出。
2) 用預熱的 1×PBS 洗滌 3 次，每次 10 分鐘
3) 4% 甲醛室溫固定 20-30 分鐘
4) 用 1×PBS 洗滌 3 次，每次 10 分鐘
5) 透化0.2% Triton X-100 2-5 分鐘
6) 用 1×PBS 清洗 3 次，每次 10 分鐘
7) 用 5% BSA 室溫封閉 30 分鐘
8) 添加一抗（用 1% BSA 稀釋）放入潮濕盒中，4度過夜
9) 用1×PBS清洗3次，每次10分鐘
10）加入二抗（1%BSA稀釋）30分鐘，關燈！ !!
11) 用 1×PBS 清洗 3 次，每次 10 分鐘
12) 用 95% 甘油封片
注：4% 甲醛、0.2% Triton、5% BSA 均用 1×PBS 稀釋"

細胞載玻片的免疫熒光
1)取出細胞載玻片放入35mm或60mm用過的培養(yǎng)皿中，用PBS洗滌3次。
有時制作的細胞玻片可能比較小，所以挑取時要小心，注意反面，放在培養(yǎng)皿中清洗比較方便，避免來回剪切，清洗時加PBS，不要洗太多，不要沖洗細胞。洗的時候我總是多加一些PBS，稍微搖晃一下就倒掉，不用等5分鐘或者10分鐘。
2) 4%冷多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗滌3次。
3) 用0.2% Triton X-100 透化10 分鐘，用PBS 洗滌3 次。
4)與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗滌3次。
5) 一抗可在濕化盒中4度保存過夜，或37度保存2小時。感覺前者有效。用 PBS 清洗 3 次。
6）二抗室溫放置2小時（避光），或37度1個半小時，PBS洗3次。
7）最好用DAPI對細胞核進行染色，然后直接拍攝熒光膠片。
8) 用蒸餾水洗掉PBS，用甘油封膜，并用指甲油封膜周圍。因為甘油不像樹脂那樣干燥，如果不用指甲油密封的話就會亂七八糟。

細胞免疫熒光簡單實驗
1）將血清蛋白H7.2-7.4在37度PBS中沖洗2小時。
2) -20度甲醇固定20分鐘后，自然干燥10分鐘
3) PBS清洗：3min*3
4) 1% Triton：25min-30min。配成50ultriton+5ml pBS
5) PBS洗：2*5min
6) 羊血清封閉：37度，20分鐘
7) 一抗，4度過夜，一般18小時以上或37度1-2小時
8) 4度PBS洗，3min*5次
9）二抗37度不到一小時
10）37度PBS洗，干燥3*5min，密封（封閉液PH8.5）

無論采用何種方法，用PBS緩沖液漂洗時，必須漂洗干凈，并測量pH值。可以用PBS清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間。如果結果背景較高，可以延長漂洗次數。和時間。

如何解決免疫熒光染色底色過重的問題？詳細講解實驗操作及注意事項
四、免疫熒光染色注意事項
1）熒光試劑應妥善保管

盡管許多熒光團相對光穩(wěn)定，但在儲存和染色過程中未能避光可能會導致熒光團-抗體綴合物降解，從而導致假陰性結果。因此，熒光物質必須在建議的溫度下小心儲存，并始終避光，以保護其光譜完整性。

2) 仔細選擇熒光 免疫熒光
技術的一個主要優(yōu)點是它提供了多重檢測的機會，如今流式細胞術可以測量每個細胞 20 多個離散參數。在設計多重實驗時，應考慮每種熒光團的性質，例如吸收和發(fā)射最大波長、消光系數和斯托克斯位移。

3）適當的對照是必要的
任何實驗數據的分析都依賴于相關的對照，免疫熒光染色也不例外。每次檢測需設置以下三個對照：
(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記
(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記
(3) 熒光標記對照：PBS+熒光標記

5、免疫熒光實驗常見問題排查指南
1）背景染色太強
背景染色太強，意味著除了我們希望看到的特異染色在前景中起主導作用外，還有一幫吃瓜群眾（與我們想要看到的特定染色相同的顏色）在后面。

到底是什么原因導致這些演員搶了主角的戲呢？可能的原因如下。

組織切片太厚：這種情況，可以選擇將組織切片變薄。

封閉不良：封閉的目的是減少非特異性結合，減少背景染色。如果背景太強，考慮更換封閉液或增加封閉孵育時間

二抗具有非特異性結合：要驗證是否存在這種情況，可以制作空白對照，只在染色過程中添加二抗（也就是說一抗不要使用特異性一抗）孵育過程，例如使用一抗稀釋液進行孵育一抗的步驟）。如果空白對照被染色，則表明二抗具有非特異性結合。此時，建議更換二抗。

自發(fā)熒光：要了解組織是否具有自發(fā)熒光，請在非染色區(qū)域尋找熒光。一些自發(fā)熒光來自固定步驟，可以避免戊二醛固定或用 PBS 中的 0.1% 硼氫hua鈉清洗以去除游離醛基。還有一些來自內源性熒光分子的熒光，可以用蘇丹黑/硫酸銅進行光漂白。

抗體濃度過高：降低所用抗體濃度或調整孵育時間。

洗滌不充分：染色的步驟較多，而洗滌的步驟也較多。實驗過程中要確保洗滌到位，不要偷工減料。

2）染色弱或無染色
可能的原因有：您要研究的目的蛋白在組織本身中不存在或表達量很小。

如果懷疑目的蛋白不存在，可以通過WB等多種方法進行驗證。由于不同蛋白質探索實驗的原理和操作不同，結果可能會有所不同，多次實驗的驗證更容易避免假陰性。如果感興趣的蛋白質表達量較小，則可以考慮采取額外的步驟來放大熒光信號。

熒光顯微鏡的問題。

如果熒光顯微鏡的參數設置不正確，可能看不到熒光。例如，光源/濾光裝置與您想要檢測的熒光不匹配。每次拍照時，記得檢查參數是否正確。

曝光時間太短或光吸收太低（增益值太低）：您可以嘗試增加增益值和/或增加曝光時間以找到最佳值。

曝光時間過長，發(fā)生熒光猝滅：避免切片過度曝光。使用后立即將切片存放在黑暗中。

細胞/組織的過度固定：因為過度固定會使表位被遮蔽，使抗體無法與抗原結合，所以當然沒有熒光。所以可以盡量減少固定時間，也可以嘗試做抗原修復來揭示抗原表位。

組織/細胞干燥：確保切片在整個染色過程中保持濕潤。

如果細胞沒有透化，一抗就無法進入：例如，如果你要研究的目標蛋白在細胞內，但由于沒有鉆石，抗體無法進入細胞并與目標蛋白待在一起，那么你當然看不到它們。愛的火花。所以，我們可以想辦法讓細胞打開綠色通道，架起喜鵲之橋。例如，如果使用甲醛固定組織細胞，則可以使用 0.2% Triton X-100 對細胞進行透化（濃度可能因實驗而異）。對于用甲醇或丙酮固定的組織細胞，不需要 Triton X-100，因為前者可以透化細胞。

一抗用量不足/孵育時間太短：增加抗體濃度或延長孵育時間

一抗不適合：在購買一抗之前，記得閱讀產品信息，并不是所有的一抗都可以用于免疫熒光染色實驗。另外，請確保產品尚未過期。

一抗和二抗不兼容：例如，如果您的組織來源是小鼠，那么一抗應該是某種動物抗小鼠，例如山羊抗小鼠，那么二抗應該是某種動物抗體山羊，如兔抗羊。也就是說，二抗應該針對一抗宿主。

切片保存時間過長：樣本染色后應盡快觀察拍照，否則信號會隨著時間的推移而減弱。考慮將切片盡可能長時間地保存在 4?C 避光條件下。

抗體儲存問題：避免反復冷凍和解凍抗體，因為這可能會導致抗體降解。建議購買抗體后，根據每次實驗的需要，將抗體分成幾小份保存，以便每次使用一小管。另外，存放前記得閱讀使用說明書，并按照使用說明書的說明進行存放。比如具體的儲存溫度、是否避光等。