建議及技巧：

用于蛋白檢測的Duolink® PLA技術(shù)可提供一種具有一系列明確定義步驟的簡(jiǎn)易而直接的實(shí)驗方法。該章節將會(huì )對可確保Duolink® PLA實(shí)驗順利進(jìn)行的一些重要注意事項進(jìn)行描述。

一、前期考慮：

1.采用在待測樣品內可具有最佳一抗性能的條件。這些條件包括樣品處理參數（固定、通透化、抗原修復等）、一抗效價(jià)以及孵育時(shí)間。

2.為了可對結果進(jìn)行正確的評估，在實(shí)驗中總是需要設置技術(shù)及可用的生物學(xué)對照。

3.Duolink® PLA Control Kit是一款可對技術(shù)進(jìn)行檢測并獲取成功結果的便捷工具。它包含有利 Duolink® PLA試劑進(jìn)行蛋 白間相互作用觀(guān)察的帶有預鋪板細胞的顯微玻片以及一對抗體。PLA信號是具有保障的。采用該款對照試劑盒可提升Duolink® PLA技術(shù)的可靠性或為您的實(shí)驗增添更多的對照。

二、常見(jiàn)實(shí)驗參數：

1.永遠不要讓您的樣品變干。在加濕箱中進(jìn)行孵育步驟。

2.確保去除樣品中多余的洗滌溶液。殘留的洗滌溶液會(huì )造成抗體的進(jìn)一步稀釋并降低連接或擴增的效率。

3.可采用一支疏水筆將樣品圈出來(lái)。當使用孔板玻片時(shí)，這將有助于防止孔間的溶液交叉污染。當使用組織切片時(shí)，這可以將所需的試劑體積降低到低值。

4.在合適的溫度及孵育時(shí)間條件下進(jìn)行所有的步驟以獲取最佳的結果，特別是酶相關(guān)的步驟（連接及擴增）。

5.在進(jìn)行低豐度蛋白檢測時(shí)，可能需要將擴增時(shí)間進(jìn)行延長(cháng)。如果在這些條件下出現背景提升，可使用Duolink®Brightfield Amplification Buffer（不含有檢測寡核苷酸）獨立進(jìn)行擴增和檢測步驟，并隨后采用Duolink®Fluorescent Amplification Buffer（含有檢測寡核苷酸）進(jìn)行一步30分鐘的孵育。

6.在大量的洗滌溶液中進(jìn)行洗滌并確保樣品被覆蓋。按要求分別使用洗滌溶液A或B。在室溫進(jìn)行洗滌。

7.在使用過(guò)程中將酶放置在冰凍模塊中。確保其他的試劑解凍（如連接溶液和擴增溶液）并在使用前進(jìn)行渦旋混勻。

三、樣品儲存及分析：

1.所有的® PLA探針必須儲存在4 °C；包括使用Duolink® Probemaker生成的。不要凍存，否則結果將會(huì )被顯著(zhù)減弱。

2.對于熒光相關(guān)的應用，在使用帶有DAPI的Duolink® Mounting Media進(jìn)行封片后將玻片避光儲存在4 °C最長(cháng)可達4天。密封儲存在-20 °C最長(cháng)可達6個(gè)月。

3.不可過(guò)度曝光。熒光信號會(huì )發(fā)生聚結使得獲取準確的定量分析結果更加困難。需要注意的時(shí)，信號聚結并不會(huì )影響流式細胞分析。

4.實(shí)驗及對照樣品應采用相同的捕獲參數進(jìn)行拍照成像。

四、故障排除：

盡管注意到了所有的注意事項，也使用一些很好的建議和技巧，結果有時(shí)也不是會(huì )符合預期。陽(yáng)性對照無(wú)信號以及高背景是免疫檢測實(shí)驗中最為常見(jiàn)的兩種問(wèn)題，并在使用Duolink® PLA技術(shù)時(shí)也有可能會(huì )發(fā)生。下表列舉了這些常見(jiàn)問(wèn)題的可能誘因以及建議的解決方案。