隨著(zhù)反相快速色譜法在反應混合物純化中的使用增加，出現了很多問(wèn)題，因為許多化學(xué)家不像正相或硅膠柱色譜法那樣熟悉這項技術(shù)?；瘜W(xué)家提出的問(wèn)題之一是關(guān)于 pH 調節劑（特別是酸）的使用及其純化。

在反相占主導地位的 HPLC 領(lǐng)域，通常使用酸（甲酸、乙酸等），通常濃度為 0.1%。其基本原理是，如果樣品成分在溶液中可電離，則其色譜保留和峰形可能會(huì )受到影響，并且其定量也會(huì )受到挑戰。

電離/可電離化合物在溶液中時(shí)在帶電狀態(tài)和中性狀態(tài)之間保持平衡。這些分子在中性溶劑系統中進(jìn)行色譜分析時(shí)，可以顯示為前峰（想想滑雪坡），因為電離部分比中性狀態(tài)更易溶于水，因此洗脫得更快。添加 pH 調節劑，無(wú)論是酸還是堿，都可以迫使平衡全進(jìn)入中性狀態(tài)或進(jìn)入電離狀態(tài)。當全電離時(shí)，化合物會(huì )提前洗脫；當中性時(shí)，該化合物更具疏水性，并且其在柱上的保留增強。

例如，我們來(lái)看看通過(guò)琥珀酸酐和 α-甲基芐胺的微波反應生成的合成 N-(1-苯乙基)琥珀酰亞胺的純化，如圖 1 所示。

圖 1. 使用 Biotage® Initiator+ 微波反應器進(jìn)行琥珀酸酐與 α-甲基芐胺的反應

當使用中性溶劑純化時(shí)，產(chǎn)品前沿很差，表明它處于電離態(tài)和中性態(tài)之間的平衡，圖 2。

圖 2. 使用中性水和乙腈的反應混合物反相快速色譜顯示前沿產(chǎn)物峰。

產(chǎn)品作為非高斯前沿峰洗脫的問(wèn)題是，它是一個(gè)寬廣的峰，并且收集在多個(gè)柱體積 (CV) 中。這意味著(zhù)收集的產(chǎn)物被稀釋在比典型或期望更多的溶劑中，這增加了蒸發(fā)餾分溶劑的體積和時(shí)間，并增加了較低純度和回收率的可能性。事實(shí)上，該反應混合物中存在較早洗脫的副產(chǎn)物，其污染了早期產(chǎn)物級分。是的，這些餾分可以被丟棄，但這會(huì )降低回收的產(chǎn)品產(chǎn)量，這不一定是理想的解決方案。

通過(guò)將酸（在本例中為0.2%冰醋酸）引入到水和乙腈中，可電離的反應混合物組分質(zhì)子化。質(zhì)子化產(chǎn)物的洗脫帶減少（銳化），從而增加了其濃度以及與污染副產(chǎn)物的分離，圖 3。副產(chǎn)物也質(zhì)子化，導致其比中性流動(dòng)相更早洗脫。結果是大大改善了分離，產(chǎn)物以更集中的譜帶洗脫，并且與副產(chǎn)物的分離度更高。

圖 3. 使用酸化溶劑系統純化反應混合物，使產(chǎn)物峰尖銳并降低干擾副產(chǎn)物的保留。

然而，化學(xué)家在使用 pH 值修改的流動(dòng)相時(shí)需要小心，因為潛在的化合物保留隨 pH 值變化而變化。在前面的例子中，電離化合物移動(dòng)是有幫助的，但質(zhì)子化化合物并不總是朝著(zhù)有利的方向移動(dòng)。當 pH 值發(fā)生變化時(shí)，洗脫的化合物可能會(huì )相互靠近甚至共洗脫。

我們可以看到這種情況發(fā)生在由靛紅酸酐和 α-甲基芐胺微波反應生成的合成產(chǎn)物 2-氨基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺中，圖 4。

圖 4. 靛紅酸酐與 α-甲基芐胺的微波反應

當使用中性水/甲醇梯度純化時(shí)，我們可以看到一些極性副產(chǎn)物在產(chǎn)品之前洗脫，以及強烈保留的副產(chǎn)物在產(chǎn)品后面以 9.5 至 14 CV 之間的寬峰形式洗脫，圖 6。

圖 6. 反應混合物的 pH 中性反相快速色譜

在兩種洗脫溶劑中添加 0.2% 冰醋酸后，洗脫化合物的保留率發(fā)生顯著(zhù)變化。副產(chǎn)物在中性 pH 值下以 4 CV 洗脫，在酸性條件下離子化并以 1.5 CV 洗脫。尾隨的疏水性副產(chǎn)物也電離并移近產(chǎn)物，圖 7。

圖 7. 使用酸化水/甲醇梯度純化反應混合物，改變了兩種副產(chǎn)物的保留。

隨著(zhù)產(chǎn)物和尾隨副產(chǎn)物之間分辨率的降低，該反應純化的負載能力降低，這意味著(zhù)需要更大的柱（和更多的溶劑）來(lái)充分純化反應產(chǎn)物。

因此，雖然流動(dòng)相 pH 值調整有助于改善純化，但請注意，洗脫體積和選擇性可能會(huì )發(fā)生變化，從而可能降低純化效率。

用于創(chuàng )建此數據的設備包括：

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• Biotage®引發(fā)劑+微波反應器

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• Biotage® Selekt Single 快速色譜系統

• Biotage® Sphere C18 色譜柱，12 克