CLiM™親和標簽系統

CLiM ™ 親和標簽系統基于兩種小蛋白質(zhì)之間形成的超高親和力復合物。 CL7 (16 kDa) 是與靶蛋白融合的標簽，lm7 (10 KDa) 是與瓊脂糖樹(shù)脂偶聯(lián)的配體。 

CL7 的 WT 版本是 CE7 DNase，一種有毒細菌蛋白。工程突變消除了其 DNA 結合和 DNAse 活性，同時(shí)保留了與 lm7 的超高親和力。

成分 

CL7標簽

CL7 標簽可以表達在目標蛋白的 N 或 C 末端。我們的質(zhì)粒提供溶解度標簽、親和標簽和切割位點(diǎn)的組合以及多種克隆選項。

在對照實(shí)驗中，CL7 對溶解度或表達沒(méi)有表現出負面影響。事實(shí)上，當在沒(méi)有標簽的大腸桿菌中表達時(shí)，CL7 提高了原本不溶的蛋白質(zhì)的表達水平和溶解度。當用 CL7 標簽表達時(shí)，一些臨床和治療相關(guān)的蛋白質(zhì)從不溶性部分轉移到可溶性部分。純化可溶表達的蛋白質(zhì)不需要變性劑或包涵體重折疊。這些蛋白質(zhì)在基于細胞的測定中表現出與其他商業(yè)/臨床樣品相同的生物活性。

Im7樹(shù)脂

lm7 樹(shù)脂由固定在瓊脂糖樹(shù)脂上的 CL7 結合伴侶 lm7 組成。 lm7 和 CL7 之間的高度特異性親和力導致樹(shù)脂脫靶最小化。 35-40 mg/mL 的高樹(shù)脂結合能力可以捕獲大量 CL7 標記的蛋白質(zhì)。 lm7 結構域具有高度彈性：使用 Gdn-HCI，樹(shù)脂可以再生并重復使用多達 100 次。

洗脫蛋白酶

蛋白酶對于從 lm7 樹(shù)脂柱上洗脫目標蛋白至關(guān)重要。 TriAltus 生產(chǎn)自己的高活性、超高親和力純度的 SUMO 和 PSC 蛋白酶。這兩種 TriAltus 蛋白酶的裂解速度比競爭對手的產(chǎn)品更快，而且成本更低。 

例如，如果 60-80 mg 蛋白質(zhì)與 5 mL 柱結合，則 1 mg 蛋白酶溶于 20 mL 洗脫緩沖液中，流速為 0.2 mL/min，只需 1.5-2 小時(shí)即可洗脫蛋白質(zhì)。少量的蛋白酶太稀了，可能不需要去除。如果需要，可以使用用于 SUMO 的鎳柱和用于 PSC 的谷胱甘肽來(lái)執行拋光步驟。 

SUMO 

SUMO 蛋白酶用于洗脫 N 末端標記蛋白。這種高度特異性的酶可識別 SUMO 結構域的三級結構并切割其 C 端，切割后不留下任何氨基酸殘基。其特異性使其切割速度比 PSC 更快。 4°C 下， 1  μg SUMO 在 30 分鐘內將 2 mg 底物裂解 96%，在 40 分鐘內裂解 99%。

PSC 

PSC 蛋白酶用于切割 N 或 C 末端標記的蛋白質(zhì)。它也非常高效：在 4 °C 下，20 μg PSC 將在 40 分鐘內以 91% 的速度裂解 2 mg 底物，在 60 分鐘內以 99% 的速度裂解 。

一步層析純化方案 

CL7 和 Im7 的鹽獨立性和高度特異性的結合親和力可實(shí)現簡(jiǎn)單且簡(jiǎn)化的實(shí)驗方案。 CL7 不是使用 His-trap 作為第一步，然后使用特殊標簽來(lái)精煉蛋白質(zhì)，而是通過(guò)一個(gè)色譜步驟即可實(shí)現超高純度。

優(yōu)點(diǎn)

蛋白質(zhì)純化系統根據其在兩個(gè)參數下的性能進(jìn)行評估：產(chǎn)量和純度。  CLiM™  親和標簽系統在兩個(gè)賬戶(hù)上的表現都優(yōu)于 His 標簽和特殊標簽。 

屈服

TriAltus 的高結合能力樹(shù)脂的高效偶聯(lián)方法遠遠優(yōu)于其他專(zhuān)用標簽的樹(shù)脂。 lm7 6B 樹(shù)脂的結合能力在 35-40 mg/mL 范圍內，4B 樹(shù)脂的結合能力 >60 mg/mL。 

純度

蛋白質(zhì)純化系統可達到的純度取決于其對未標記細胞成分的敏感性。雜質(zhì)類(lèi)型包括基于標記靶蛋白/細胞成分相互作用的雜質(zhì)以及由于未標記細胞成分與柱結合配體的非特異性結合而產(chǎn)生的雜質(zhì)。 

與靶蛋白的相互作用

在高鹽濃度緩沖液存在的情況下，CL7 與 Im7 的結合不受干擾。高鹽緩沖液可在純化過(guò)程的早期去除雜質(zhì)，以獲得潔凈的最終產(chǎn)品。特殊標簽對約 0.2-0.3 M 的鹽濃度敏感，導致第一個(gè)色譜步驟后純度較低。

非特異性結合

CL7 和 Im7 彼此具有高度的特異性。這可以防止標簽或配體與細胞成分（例如 DNA 和其他蛋白質(zhì)）之間的非特異性相互作用。 IMAC 系統容易與樹(shù)脂中的金屬離子發(fā)生非特異性結合。

高耐鹽性和高特異性結合的結合導致了如此高的純度，以至于 CL7/lm7 系統僅需要一個(gè)色譜步驟。

純化的具有挑戰性的蛋白質(zhì)

多亞基RNA聚合酶-ttRNAP

ttRNAP（嗜熱菌RNA 聚合酶）是一種約 400 kDa 的大蛋白，具有 5 個(gè)亞基 ( α 2 ββ'ω) 和 4 個(gè)結合位點(diǎn)。傳統上，純化需要五個(gè)連續的層析步驟才能獲得足夠高的純度以實(shí)現高活性。蛋白質(zhì)純度與其活性直接相關(guān)。將細胞裂解物裝入 1.5 M 鹽緩沖液中是一步純度的關(guān)鍵。 CL7 標簽僅附著(zhù)在最大的 β' 亞基上， 不會(huì )干擾亞基組裝。 

DNA/RNA 結合蛋白 - Cas9

Cas9是CRISPR技術(shù)的重要組成部分。 Cas9 活性與其純度直接相關(guān)，但通常需要 4-5 個(gè)色譜步驟才能達到所需的純度。 Cas9 帶有 CL7 標簽并加載在 1.5 M 鹽緩沖液中，一步純化即可達到 99% 的純度。該酶在細胞檢測和 體外 檢測中均顯示出高活性。 

膜蛋白-YidC

YidC 是一種~32 kDa 細菌膜整合酶。膜蛋白很難純化，因為與細胞成分的疏水接觸會(huì )造成污染。由于組氨酸標簽非特異性地結合到其柱上，因此在一步純化后會(huì )出現大量雜質(zhì)。 CL7 對 Im7 的特異性最大限度地減少了這些影響，使純度高達 99%。

折疊不良的治療蛋白 - GCSF、hGH 和 IFN- α

FDA 批準的三種生物制劑——GCSF、hGH 和 IFN-α——各自具有兩個(gè)內部半胱氨酸橋，在沒(méi)有標簽的大腸桿菌中表達時(shí)通常不溶。純化不溶性蛋白質(zhì)通常涉及棘手的重折疊步驟，然后是多個(gè)色譜步驟。 CL7 增強蛋白質(zhì)的表達、穩定性和折疊，使它們不再以包涵體形式表達。這些蛋白質(zhì)表現出與基于細胞的陣列中的其他商業(yè)/臨床樣品相當的生物活性。