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免疫組織化學(xué)故障排除

更新時(shí)間:2024-01-02      點(diǎn)擊次數(shù):376

弱染色或無染色


 

來源

解決方案

脫蠟不充分延長切片脫蠟時(shí)間或更換新鮮二甲苯
無活性的一抗更換新一批抗體
由于儲(chǔ)存不當(dāng),抗體無法發(fā)揮作用將抗體分裝成較小的體積并儲(chǔ)存在冰箱中(-20 至 -70°C),并避免重復(fù)凍融循環(huán)?;蚋鶕?jù)制造商的說明儲(chǔ)存抗體。
抗體濃度太低增加一抗和/或二抗的濃度?;蛘哌\(yùn)行連續(xù)稀釋測試以確定提供最佳信噪比的最佳稀釋度
抗體 孵育時(shí)間不足增加抗體 孵育時(shí)間
組織固定不充分或不正確增加后固定時(shí)間或嘗試不同的固定劑
組織過度固定減少后固定的持續(xù)時(shí)間。如果組織已經(jīng)過度固定,請(qǐng)執(zhí)行適當(dāng)或推薦的抗原修復(fù)程序。
二抗和一抗不相容使用可與一抗相互作用的二抗。例如,如果一抗是從兔子中產(chǎn)生的,則使用抗兔二抗
無活性二抗更換新一批抗體
無活性 ABC 試劑更換新一批試劑
酶底物 系統(tǒng)有缺陷或不相容更換新一批試劑
底物孵育時(shí)間不足增加底物孵育時(shí)間
封固劑不正確選擇正確的封固劑
試劑使用順序錯(cuò)誤或步驟省略檢查注釋或使用的程序

 

過度染色

 

來源

解決方案

一抗和/或二抗?jié)舛冗^高降低抗體濃度或進(jìn)行滴定以確定一抗和二抗的最佳稀釋度
孵化時(shí)間太長減少孵化時(shí)間
孵化溫度太高降低孵化溫度
底物 孵育時(shí)間太長減少底物孵育時(shí)間
切片變干避免切片變干

 

高背景

 

來源

解決方案

切片清洗不充分步驟之間至少清洗 3 次
組織含有內(nèi)源性酶,例如過氧化物酶或堿性磷酸酶在孵育一抗之前,使用甲醇或左旋咪唑溶液(阻斷 AP)中的 3% 過氧化氫(阻斷過氧化物酶)阻斷內(nèi)源酶活性。
組織含有內(nèi)源性生物素活性在孵育一抗之前,使用親和素/生物素封閉試劑封閉內(nèi)源生物素活性。
一抗與組織非特異性結(jié)合或抗體濃度過高使用較高稀釋度的一抗可以減少非特異性結(jié)合
二抗與組織的非特異性結(jié)合用來自同一物種的正常血清作為二抗處理組織。
二抗與類似物種的組織發(fā)生交叉反應(yīng),即兔抗大鼠 IgG 可能與小鼠組織發(fā)生交叉反應(yīng)。使用預(yù)吸附的第二抗體,即在小鼠組織上使用兔抗大鼠IgG,小鼠吸附,或在大鼠組織上使用兔抗小鼠IgG,大鼠吸附。
由于固定不充分導(dǎo)致組織抗原擴(kuò)散增加后固定時(shí)間
用于小鼠組織的小鼠抗體一抗孵育前用 MouseOnMouse 封閉試劑處理組織

切片變干

避免切片變干



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