檢測的每個(gè)組成部分包括一抗和二抗、封閉劑、緩沖液、酶綴合物和底物，可以對其進(jìn)行優(yōu)化，以提高新開(kāi)發(fā)的ELISA工作方案的性能。測試了不同濃度和時(shí)間的包被、封閉、樣品培養和檢測步驟，以找到檢測的最佳條件。通常，一次測試一種成分，然而在某些情況下，可以通過(guò)應用棋盤(pán)滴定網(wǎng)格方法同時(shí)優(yōu)化兩種成分，如下所示:

圖2:棋盤(pán)滴定網(wǎng)格法同時(shí)優(yōu)化兩種ELISA成分。本例顯示了組件A與組件B的對比，所有其他組件保持不變。

優(yōu)化涂層過(guò)程

可以在包被緩沖液中制備不同濃度的包被劑（靶抗原或捕獲抗體），并且可以應用等體積的每種濃度來(lái)執行ELISA方案，以發(fā)現強信號對低背景的趨勢。在某些情況下，根據涂布劑的性質(zhì)，可能還需要優(yōu)化涂布緩沖液和平板涂布時(shí)間的選擇。

優(yōu)化阻塞過(guò)程

可以使用ELISA方案測試相同體積的不同制備的或市售的封閉溶液，以確保非特異性結合最少，而不會(huì )影響檢測信號強度。如果封閉溶液是內部制備的，可以調節不同濃度的封閉劑。

優(yōu)化樣品濃度

用于樣品制備以生成校準曲線(xiàn)的標準稀釋劑應盡可能模擬天然樣品基質(zhì)并測試不同的成分。用ELISA方案測試相同體積的連續稀釋樣品濃度?？梢源_定樣品的標準曲線(xiàn)濃度和稀釋線(xiàn)性的良好動(dòng)態(tài)范圍。樣品稀釋劑可能需要根據動(dòng)態(tài)范圍的光譜進(jìn)行調整。

優(yōu)化檢測過(guò)程

在標準稀釋液中制備的不同濃度的檢測抗體可以用ELISA方案進(jìn)行等體積測試，以找到適合強信號和低背景噪聲的濃度。

辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶是ELISA中常用的兩種報告酶。在標準稀釋劑中制備的不同濃度的酶綴合物或酶綴合的二抗通過(guò)測試板中每種濃度的等體積并進(jìn)行ELISA方案進(jìn)行優(yōu)化?？梢源_定產(chǎn)生具有最小背景噪聲的強信號的濃度。底物需要對在動(dòng)態(tài)范圍內清晰檢測的靶抗原敏感，并且能夠用合適的儀器檢測。

下表列出了包被和檢測抗體及酶偶聯(lián)物的推薦濃度范圍，可用于確定比色ELISA優(yōu)化的最合適實(shí)驗條件。對于酶綴合物，查看制造商的說(shuō)明書(shū)以了解更具體的濃度范圍?？梢允褂梦醇兓目贵w，但可能需要比純化抗體更高的濃度，并可能導致更高的背景噪聲。建議使用親和純化的抗體以獲得最佳信噪比。建議的濃度范圍僅供參考；每個(gè)組件的單獨優(yōu)化將提供更好的結果。

表2:包被和檢測抗體和酶綴合物的推薦濃度范圍