人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA Kit

【實(shí)驗方法】雙抗體夾心法

【種屬】人

【檢測范圍】 見(jiàn)說(shuō)明書(shū)

【檢測波長(cháng)】450 nm

【樣本類(lèi)型】血清、血漿、組織、細胞上清及相關(guān)液體樣本

【反應時(shí)間】 1.5~2h

人腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析(ELISA) 試劑盒使用說(shuō)明書(shū) 貨號：JYM0110Hu ? 本試劑盒僅供科研使用。 ? 本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關(guān)液體 樣本中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。 ? 有效期：6個(gè)月 ? 保存條件：2-8℃

實(shí)驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的 人腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次 加入腫瘤壞死因子α(TNF-α)，再與HRP標記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體結合，形 成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過(guò)洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下 轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子 α(TNF-α)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（OD值），通過(guò)標準曲線(xiàn)計算 樣品中人腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度。

試劑盒組成

樣本處理及要求 1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細 收集上清，保存過(guò)程中如出現沉淀，應再次離心。 2. 血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離 心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應 該再次離心。 3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存 過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。 4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時(shí)，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液， 細胞濃度達到 100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離 心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應 再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保 存備用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或 勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。分 裝后一份待檢測，其余冷凍備用。 6. 標本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻進(jìn)行，提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能 馬上進(jìn)行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融. 7. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟 1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在第一、第二孔中分別加 標準品 100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后從第一 孔、第二孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準 品稀釋液 50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻； 混勻后從第五、第六孔中各取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔 中分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、 第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各 取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，濃度分別為 300 pg/ml,200 pg/ml, 100 pg/ml, 50 pg/ml , 25pg/ml）。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測 樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁， 輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標試劑 50ul，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。 5. 配液：將 30(48T 的 20 倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30(48T 的 20 倍)倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如 此重復 5 次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50ul，再加入顯色劑 B50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯 色 10 分鐘.

8. 終止：每孔加終止液 50ul，終止反應（此時(shí)藍色立轉黃色）。 9. 測定：以空白孔調零，450nm 波長(cháng)依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終 止液后 15 分鐘以?xún)冗M(jìn)行。 注意事項 1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開(kāi)封后如 未用完，板條應裝入密封袋中保存。 2. 濃洗滌液可能會(huì )有結晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結果。 3. 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時(shí)間最 好控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 4. 請每次測定的同時(shí)做標準曲線(xiàn)，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高（樣本 OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定， 計算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。 5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6. 底物請避光保存。 7. 嚴格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準. 8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 9. 本試劑不同批號組分不得混用。 10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準。 計算 以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標， 在坐標紙上繪出標準曲線(xiàn)，根據樣品的 OD 值由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度；再乘以稀釋 倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標 準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的 OD 值 代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數，即為樣品的實(shí)際濃度。

試劑盒性能 1.樣品線(xiàn)性回歸與預期濃度相關(guān)系數 R 值為 0.92 以上。 2.批內與批間應分別小于 9%和 15% 檢測范圍： 5pg/ml -400pg/ml

上海牧榮生物科技有限公司

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