一、樣品選擇

對樣品和蛋白質(zhì)靶標的已有了解十分重要。選擇具有已知靶蛋白表達的系統將顯著(zhù)增加Duolink® PLA實(shí)驗成功的幾率。

Duolink® PLA實(shí)驗所需的樣本與用于傳統免疫熒光 (IF)、免疫組織化學(xué) (IHC) 或流式細胞術(shù)的樣本相同。因此，Duolink® PLA試劑適用多種樣品類(lèi)型，包括：

1.貼壁細胞

2.懸浮細胞

3.血細胞

4.細胞離心涂片制劑

5.石蠟包埋細胞樣品

6.石蠟包埋組織切片

7.冰凍組織切片

8.新鮮組織切片

在進(jìn)行 Duolink® PLA 實(shí)驗之前，必須對所有樣品進(jìn)行固定。對于流式細胞術(shù)應用，需要使用懸浮細胞。

選擇讀出方法：

Duolink® PLA產(chǎn)品提供了熒光和明場(chǎng)版本選擇。熒光 Duolink® PLA 試劑可用于顯微鏡和流式細胞術(shù)應用。

選擇讀出方法的關(guān)鍵考慮因素是專(zhuān)用設備的可用性。熒光顯微鏡是 Duolink® PLA 實(shí)驗常用的讀出設備。上述所有樣品類(lèi)型均可與熒光Duolink® PLA 試劑一起使用，不過(guò)，部分樣品會(huì )表現出明顯的自發(fā)熒光。如果發(fā)生這種情況或當熒光儀器不可用時(shí)，可用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行明場(chǎng)Duolink® PLA實(shí)驗。

流式細胞術(shù)方案對于儀器類(lèi)型是不可知的（假設實(shí)驗設計所需的合適濾光片可用），并且較易于適用于貼壁或懸浮細胞。

二、樣品處理

樣品應在固定、透化和抗原修復方面進(jìn)行適當的處理。實(shí)驗中所用一抗的條件優(yōu)化對檢測性能至關(guān)重要。

固定：

固定過(guò)程用于固定抗原，同時(shí)保留細胞和亞細胞結構。固定劑的選擇可根據樣品類(lèi)型（細胞或組織）、一抗和蛋白靶標的不同而不同。不同的固定劑可影響一抗的抗原性，從而影響一抗的性能。如果所選一抗沒(méi)有推薦固定方法，則必須由用戶(hù)進(jìn)行優(yōu)化。

Duolink® PLA試劑與 IF 和 IHC 的所有常用固定劑兼容，包括：

1.丙酮

2.乙醇

3.甲醛

4.甲醇

5.多聚甲醛

6.鋅

透化：

抗體進(jìn)入細胞內表位需要透化作用。這通常是通過(guò) Triton X-100、NP-40、Tween-20 或 digitonin等去垢劑來(lái)實(shí)現。有許多去垢劑可供選擇——使用一種適合固定和所用樣品的去垢劑。值得注意的是，一些固定劑（如丙酮和甲醇）也會(huì )引起透化，因此可能不需要額外的透化步驟。

抗原修復：

抗原修復用于顯示在固定過(guò)程中被掩蓋的抗原表位，從而允許抗體結合?？乖迯统Ｓ糜诟栺R林固定的石蠟包埋 (FFPE) 樣品，但有時(shí)也用于懸浮固定的細胞。不同的抗原修復方法可能影響一抗的性能，因此必須由用戶(hù)進(jìn)行優(yōu)化。

兩種主要方法是熱誘導抗原修復法 (HIER) 和酶誘導抗原修復法 (PIER)。Duolink® PLA 與 IHC 的常用抗原修復緩沖液兼容，包括：

HIER：Trilogy™、檸檬酸鹽、EDTA 和高 pH Tris

PIER：用蛋白酶 K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理