分子克隆是分子生物學(xué)中用于組裝重組DNA分子的一組實(shí)驗(yàn)方法。

基于質(zhì)粒的克隆包括 4 個(gè)主要步驟：

• 插入 DNA 制備

• 載體DNA制備

• 插入片段與載體的連接

• 轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞

在下面的示例中，我們將描述如何使用 SgfI 和 MluI 將目標(biāo)插入片段亞克隆到載體中。

插入 DNA 制備

1. 對(duì)含有插入片段的載體進(jìn)行限制性消化

1. 用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化含有插入片段的載體 DNA。對(duì)于我們的示例，使用的限制性位點(diǎn)是 SgfI 和 MluI 位點(diǎn)。 OriGene 擁有全基因組 cDNA 表達(dá)載體。

2. 在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行消化的插入 DNA 以檢查大小并進(jìn)行凝膠內(nèi)純化。
   OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行純化的消化插入片段以確認(rèn)濃度。濃度將進(jìn)一步有助于建立連接。

2. 從模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增
   
   如果無法用兼容的限制性位點(diǎn)切割插入片段，則可以使用 PCR 來擴(kuò)增插入片段，使其具有目標(biāo)序列側(cè)翼的所需克隆位點(diǎn)。

1. 設(shè)計(jì)包含目標(biāo)序列側(cè)翼所需克隆位點(diǎn)的引物。免費(fèi)的在線軟件程序可用于設(shè)計(jì)引物。如果手動(dòng)設(shè)計(jì)，我們建議最小長(zhǎng)度約為20bp，GC含量為40-60%，Tm為60-65°C。

2. 通過 PCR 擴(kuò)增模板中的插入 DNA。使用 PCR 純化試劑盒純化產(chǎn)物。

3. 用限制性內(nèi)切酶消化 PCR 產(chǎn)物。在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行消化的 PCR 并純化正確大小的 PCR 帶。
   OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行純化的 PCR 插入片段以確認(rèn)濃度。濃度將進(jìn)一步有助于建立連接。

載體DNA制備

1. 選擇適合您的包含多個(gè)克隆位點(diǎn) (MCS) 的克隆載體。 OriGene 擁有超過120 種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，包括病毒和非病毒形式。
   如果需要更多的載體DNA，可以使用熱休克或電穿孔方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，例如DH5 alpha。

2. 用與插入序列（例如 SgfI 和 MluI 位點(diǎn)）兼容的限制性酶消化 3-5 ug 載體。將限制性消化酶在 37°C 下孵育 1 小時(shí)。
   OTI-TIP：可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間以確保載體全消化，但不要超過 3 小時(shí)。
   OTI-TIP：為防止載體自連接，請(qǐng)用堿性磷酸酶在 37°C 下將消化載體的 5' 末端去磷酸化 30 分鐘。

3. 為了減少未切割的載體質(zhì)粒背景，我們建議在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行消化的載體，然后純化線性載體。
   OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行純化的消化載體以確認(rèn)濃度。濃度將進(jìn)一步有助于建立連接。

結(jié)扎

1. 為了成功連接，您可以使用載體：插入片段摩爾比為 1:3。
   OTI-TIP： 1:1 和 1:10 之間的載體：插入片段比例也可用于進(jìn)一步優(yōu)化連接反應(yīng)。

2. 要確定自連接產(chǎn)生的任何背景克隆，請(qǐng)?jiān)O(shè)置不含插入 DNA 的對(duì)照連接。

3. 在 16 oC 下孵育過夜（或根據(jù)連接試劑盒中的方案）。

轉(zhuǎn)型

1. 通過電穿孔或熱休克方法將 1-2 uL 連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。
   OTI-TIP：如果插入片段有毒或不穩(wěn)定，則可以使用專門允許這些插入片段成功擴(kuò)增的感受態(tài)細(xì)胞。

2. 轉(zhuǎn)移至 SOC 培養(yǎng)基中以復(fù)活轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在 37°C 下攪拌 SOC 介質(zhì) 1-2 小時(shí)。

3. 將混合物接種到裝有抗生素平板的 LB 上，并在 37°C 下孵育過夜。
   OTI-TIP：對(duì)于某些有毒插入物，可能需要較低的溫度和較長(zhǎng)的孵育時(shí)間。較小的菌落可能是正確的克隆。

4. 篩選帶有目標(biāo)插入序列的質(zhì)粒的集落。通過消化、PCR 擴(kuò)增和測(cè)序確認(rèn)