8.固相肽合成的一個(gè)例子
以下是使用堿不穩定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護基團在聚酰胺或聚苯乙烯樹(shù)脂上合成肽的合成步驟的概述。使用下面概述的技術(shù),將獲得在N-末端用乙?;舛?,在C-末端用伯酰胺(CONH2)封端的肽。
為手動(dòng)肽合成設置玻璃器皿
手動(dòng)肽合成可以在具有三通閥的燒結過(guò)濾器反應容器中完成,該三通閥通過(guò)1孔塞子安裝在1 L側臂真空燒瓶上。一個(gè)閥門(mén)用于充入氮氣,氮氣首先通過(guò)一個(gè)小的Drierite柱,然后進(jìn)入反應混合物以攪拌溶液和混合試劑。另一個(gè)閥門(mén)用于排空過(guò)量的反應溶液,并使用真空瓶洗滌溶劑。用于固相合成的所有玻璃片應在使用前用硅烷化試劑(如DCM中的1-5%二甲基二氯硅烷)處理,以避免靜電荷的積累,靜電荷的積累會(huì )使樹(shù)脂很難處理。
聚酰胺樹(shù)脂的制備
聚酰胺(PL-DMA)樹(shù)脂(1g)用乙二胺(40 ml)在50 ml Falcon管中在搖床上處理過(guò)夜,然后過(guò)濾,用5×10ml 1:1二甲基甲酰胺(DMF):二氯甲烷(DCM)溶液、5×10ml 1:1 DCM洗滌,并使用苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鹽(PyBOP) (3 eq)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBt) (3 eq)和二異丙基乙胺(DIPEA)裝載Fmoc-Rink然后可以在真空下干燥,并儲存在-15攝氏度,直到需要。
在合成前和合成過(guò)程中處理樹(shù)脂
樹(shù)脂首先在10毫升1∶1 DCM∶DMF中溶脹15分鐘,然后瀝干。每次完成氨基酸偶聯(lián)后,還用5×10ml 1:1 DCM和DMF洗滌樹(shù)脂。
Fmoc-去保護
每次氨基酸偶聯(lián)后,用2×10ml 20%哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc去保護,每次處理用N2攪拌10分鐘。然后用5×10毫升DMF洗滌樹(shù)脂,接著(zhù)用5×10毫升1:1 DCM:DMF洗滌。
添加氨基酸
為了在Fmoc-聚酰胺-Rink樹(shù)脂上開(kāi)始肽合成,通過(guò)用哌啶處理樹(shù)脂來(lái)除去Fmoc基團。然后使用在1∶1 DCM∶DMF中的PyBOP (3 eq)、HOBt (3 eq)和DIPEA (6 eq)將第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)至樹(shù)脂的Fmoc-去保護的N-末端胺,或之前偶聯(lián)的氨基酸,直到樹(shù)脂對茚三酮呈陰性。
監測氨基酸偶聯(lián)的進(jìn)展
氨基酸偶聯(lián)的過(guò)程可以用茚三酮或對氯醌來(lái)跟蹤。茚三酮溶液在游離伯胺的存在下變成深藍色(陽(yáng)性結果),但在其他情況下是無(wú)色的(陰性結果)。如果使用乙醛作為溶劑,在伯胺的存在下,或者如果使用丙酮,在仲胺的存在下,對-氯醌溶液將使樹(shù)脂珠變成深黑色或藍色;否則珠子保持無(wú)色或淡黃色。(測試概述如下)
茚三酮測試(1)
向微量離心管中加入2滴40%苯酚的乙醇溶液、2滴0.014 M KCN的吡啶溶液和4滴5%茚三酮的乙醇溶液,以及抹刀一端大小的樹(shù)脂樣品,然后渦旋混合物,并在100°c下加熱5分鐘
用氯醌測試(2)
向微量離心管中加入5滴丙酮或乙醛、5滴對氯醌的甲苯飽和溶液,以及小刮刀一端大小的樹(shù)脂樣品,然后渦旋混合物,并在室溫下靜置5分鐘。丙酮用于檢測仲胺,乙醛用于檢測伯胺。
持續肽延伸
一旦氨基酸的偶聯(lián)完成,就洗滌樹(shù)脂,用哌啶去保護Fmoc基團,并再次洗滌樹(shù)脂,為下一次偶聯(lián)做準備。重復這一過(guò)程,直到添加完所有必需的氨基酸。
乙?;疦-末端
肽序列完成后,可以用2ml 1:1乙酸酐和三乙胺在10ml 1:1 DCM:DMF中乙?;疦-末端胺1小時(shí)或直到茚三酮陰性,然后用5×10ml 1:1 DCM:DMF洗滌樹(shù)脂,然后將肽從樹(shù)脂上切下。如果需要,N-末端也可以作為游離胺留下。
從樹(shù)脂上切割肽
用3×10ml 96∶2∶2的TFA、三異丙基硅烷(TIPS)和水(H2O)處理樹(shù)脂,每次處理10分鐘,然后過(guò)濾掉樹(shù)脂,將合并的濾液靜置1小時(shí),以確保除去酸不穩定的保護基團。
從樹(shù)脂上切割后肽的處理
將TFA在旋轉蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干(或重油或玻璃,如果它不凝固的話(huà)),隨后向燒瓶中加入5 ml*醚以沉淀肽,并除去大部分副產(chǎn)物。將肽和乙*的懸浮混合物加入到50 ml Falcon管中,并以3000 rpm的速度旋轉10-20分鐘(IEC離心機),直到可以倒出乙*而不損失任何肽。加入更多的后,通過(guò)渦旋使肽重新懸浮。再次離心混合物,倒出,洗滌過(guò)程重復兩次以上。最后,產(chǎn)品可以在脫粘器中的Falcon管中風(fēng)干過(guò)夜。
通常使用制備型HPLC來(lái)純化最終產(chǎn)物。獲得質(zhì)譜數據以確保獲得目標肽。