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肽是怎么合成的?

更新時(shí)間:2024-08-06      點(diǎn)擊次數:279

在有機化學(xué)中,肽合成是肽的產(chǎn)生,肽是其中多個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵(也稱(chēng)為酰胺鍵)結合的有機化合物。

內容

 

1.化學(xué)
2.液相合成
3.固相合成
3.1.中國銀行SPPS
3.2.Fmoc SPPS
4.固體支持物
4.1.聚苯乙烯樹(shù)脂
4.2.聚酰胺樹(shù)脂
5.保護團體
5.1.Fmoc保護基團
5.2.Boc保護基團
5.3.芐氧羰基(Z)基團
5.4.Alloc保護基團
5.5.平版保護基團
6.激活組
6.1.碳化二亞胺
6.2.芳香肟
7.合成長(cháng)肽
8.固相肽合成的一個(gè)例子
9.參考

1.化學(xué)

 

肽是通過(guò)將一個(gè)氨基酸的羧基或C端偶聯(lián)到另一個(gè)氨基酸的氨基或N端而合成的。

2.液相合成

 

液相肽合成是肽合成的經(jīng)典方法。在大多數實(shí)驗室中,它已被固相合成所取代(見(jiàn)下文)。然而,它在用于工業(yè)目的的肽的大規模生產(chǎn)中仍然有用。

3.固相合成

 

Merrifield固相肽合成(SPPS)導致了肽合成領(lǐng)域的范式轉變。這是目前實(shí)驗室以合成方式制造肽和蛋白質(zhì)的方法。SPPS允許合成難以在細菌中表達的天然肽、摻入非天然氨基酸、肽/蛋白質(zhì)骨架修飾以及合成由D-氨基酸組成的D-蛋白質(zhì)。


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                       固相肽合成(SPPS)原理

小珠子用接頭處理,在接頭上可以構建肽鏈。合成珠將保持與肽的強結合,直到被試劑裂解。珠子創(chuàng )造了一種合成環(huán)境,在這種環(huán)境中,產(chǎn)生的肽鏈不會(huì )通過(guò)過(guò)濾材料,而用于產(chǎn)生肽鏈的試劑會(huì )通過(guò)。

 

重點(diǎn)考慮在每一步中產(chǎn)生高的產(chǎn)量。例如,如果每個(gè)步驟具有99%的產(chǎn)率,26個(gè)氨基酸的肽將以77%的最終產(chǎn)率合成,如果每個(gè)步驟是95%,它將以25%的產(chǎn)率合成。因此,每一種氨基酸都是以大大過(guò)量(2 ~ 10倍)添加的,并且通過(guò)一系列充分表征的試劑將氨基酸偶聯(lián)在一起是高度優(yōu)化的

 

有兩種主要的SPPS形式——Fmoc和Boc。與核糖體蛋白質(zhì)合成不同,固相肽合成以C-末端到N-末端的方式進(jìn)行。氨基酸單體的N-末端被這兩個(gè)基團保護,并被加到去保護的氨基酸鏈上。

 

自動(dòng)合成器可用于這兩種技術(shù),盡管許多研究小組繼續手動(dòng)執行spp。

 

SPPS受到產(chǎn)量的限制,通常70~100個(gè)氨基酸范圍內的肽和蛋白質(zhì)正在推動(dòng)合成可及性的極限。合成難度也依賴(lài)于序列;典型的淀粉樣肽和蛋白質(zhì)很難制造。通過(guò)使用天然化學(xué)連接將兩個(gè)肽偶聯(lián)在一起,可以獲得更長(cháng)的長(cháng)度,并具有定量的產(chǎn)量。

3.1.中國銀行SPPS

 

當R. B. Merrifield在1963年發(fā)明SPPS時(shí),它是根據tBoc方法。t-Boc(或Boc)代表叔丁氧羰基。為了從生長(cháng)的肽鏈上去除Boc,使用酸性條件(通常是純TFA)。在合成結束時(shí),通過(guò)在氫氟酸中孵育(這可能是危險的),從樹(shù)脂中除去側鏈保護基團和肽;由于這個(gè)原因,Boc化學(xué)通常不受歡迎。然而,對于復雜的合成,Boc是有利的。當合成對堿基敏感的非天然肽類(lèi)似物(如depsi肽)時(shí),Boc是必需的。

3.2.Fmoc SPPS

 

4.固體支持物                        

 

固相支持物的物理性質(zhì)及其可用于的應用,隨著(zhù)構建支持物的材料、交聯(lián)的量以及所用的接頭和手柄而變化。

4.1.聚苯乙烯樹(shù)脂

 

這是一種多功能樹(shù)脂,由于其在DCM中的溶脹最小,因此在多孔自動(dòng)化肽合成中非常有用。

4.2.聚酰胺樹(shù)脂

 

這也是一種有用和多用途的樹(shù)脂。它似乎比聚苯乙烯膨脹得多,在這種情況下,如果孔太小,它可能不適合一些自動(dòng)合成器。

5.保護團體

 

由于在每個(gè)合成步驟中使用過(guò)量的氨基酸來(lái)確保偶聯(lián),在每個(gè)氨基酸未被保護的反應中,氨基酸的聚合是常見(jiàn)的。為了防止這種聚合,使用了保護基團。這給合成反應增加了額外的去保護階段,產(chǎn)生了如下的重復設計流程:

 

• 在去保護反應中,保護基團從尾部氨基酸中被除去

• 洗去脫保護試劑以提供清潔的偶聯(lián)環(huán)境

• 溶解在溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)中的受保護的氨基酸與偶聯(lián)劑混合,泵送通過(guò)合成柱

• 洗去偶聯(lián)試劑以提供干凈的去保護環(huán)境

 

目前,固相肽合成中通常使用兩種保護基團(Fmoc,Boc)。它們的不穩定性是由氨基甲酸酯基團引起的,氨基甲酸酯基團容易釋放CO2用于不可逆的解偶聯(lián)步驟。

5.1.Fmoc保護基團

 

Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)是目前廣泛使用的保護基團,其通常在從氨基酸單元重復合成肽的過(guò)程中從肽的N末端除去。Fmoc的優(yōu)點(diǎn)是它在非常溫和的堿性條件下(例如哌啶)被裂解,但在酸性條件下穩定。這使得在堿性條件下穩定的溫和的酸不穩定保護基團,例如Boc和芐基,被用于目標肽的氨基酸殘基的側鏈上。這種正交保護基策略在有機合成領(lǐng)域很常見(jiàn)。

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5.2.Boc保護基團

 

在Fmoc基團流行之前,Boc基團通常用于保護肽的末端胺,需要在正交策略中使用更多酸穩定的基團用于側鏈保護。它保留了在合成過(guò)程中減少肽聚集的作用。Boc基團可以用boc酸酐和合適的堿加成到氨基酸上。

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5.3.芐氧羰基(Z)基團

 

另一種基于氨基甲酸酯的基團是芐氧羰基(Z)基團。它在更苛刻的條件下被去除:溴化氫/乙酸或催化氫化。今天,它幾乎用于側鏈保護。

5.4.Alloc保護基團

 

當需要鄰位去保護方案時(shí),烯丙氧基羰基(alloc)保護基團通常用于保護羧酸、羥基或氨基。有時(shí)在進(jìn)行樹(shù)脂上環(huán)肽形成時(shí)使用,其中肽通過(guò)側鏈官能團與樹(shù)脂連接??梢允褂盟?三苯基膦)鈀(0)以及氯仿、乙酸和N-甲基嗎啉(NMM)的37∶2∶1混合物2小時(shí)來(lái)除去alloc基團。然后,必須用0.5 % DIPEA的DMF溶液、3×10ml 0.5%二乙基硫代氨基甲酸鈉的DMF溶液以及5×10ml 1:1 DCM:DMF溶液仔細清洗樹(shù)脂。

5.5.平版保護基團

 

對于特殊應用,如蛋白質(zhì)微陣列,使用平版印刷保護基團。這些基團可以通過(guò)曝光去除。

6.激活組

 

為了偶聯(lián)肽,羧基通常被活化。這對加速反應很重要。有兩種主要類(lèi)型的活化基團:碳二亞胺和芳香肟。

6.1.碳化二亞胺

 

這些活化劑最初是被開(kāi)發(fā)出來(lái)的。最常見(jiàn)的是二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和二異丙基碳二亞胺(DIC)。與羧酸反應生成高活性的O-?;?。在人工蛋白質(zhì)合成過(guò)程中(如Fmoc固態(tài)合成儀),C末端通常用作氨基酸單體添加的附著(zhù)位點(diǎn)。為了增強羧酸基團的親電性,帶負電荷的氧必須首先被“活化"成更好的離去基團。DCC用于此目的。帶負電荷的氧將充當親核試劑,攻擊DCC中的中心碳。DCC暫時(shí)連接到以前的羧酸酯基團(現在是酯基團),使得氨基(在連接的氨基酸上)對以前的C-末端(碳?;?的親核攻擊更有效。碳二亞胺的問(wèn)題是它們反應性太強,因此會(huì )導致氨基酸的外消旋化。

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6.2.芳香肟

 

為了解決外消旋化的問(wèn)題,引入了芳香肟。最重要的是1-羥基-苯并三唑(HOBt)和1-羥基-7-氮雜-苯并三唑(HOAt)。


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其他的已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)了。這些物質(zhì)可以與O-?;宸磻苫钚怎?,該活性酯的活性較低,外消旋化的危險也較小。由于鄰群效應,HOAt特別有利。[1]


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最新的發(fā)展省略了碳二亞胺?;钚怎プ鳛榉怯H核陰離子(四氟硼酸鹽或六氟磷酸鹽)的脲鹽或鏻鹽引入:HBTU、HATU、PyBOP。

7.合成長(cháng)肽

 

逐步延伸,其中氨基酸逐步依次連接,對于含有2至100個(gè)氨基酸殘基的小肽是理想的。另一種方法是片段縮合,其中肽片段被偶聯(lián)。雖然前者可以延長(cháng)肽鏈而不發(fā)生外消旋化,但如果僅用于產(chǎn)生長(cháng)肽或高極性肽,產(chǎn)量會(huì )下降。對于合成復雜的長(cháng)肽來(lái)說(shuō),片段縮合比逐步延伸更好,但是為了防止外消旋化,必須限制它的使用。片段縮合也是不希望的,因為偶聯(lián)的片段必須大大過(guò)量,這可能是一個(gè)取決于片段長(cháng)度的限制。

 

產(chǎn)生更長(cháng)肽鏈的一個(gè)新進(jìn)展是化學(xué)連接:未保護的肽鏈在水溶液中發(fā)生化學(xué)選擇性反應。第一個(gè)動(dòng)力學(xué)控制的產(chǎn)物重排形成酰胺鍵。最常見(jiàn)的天然化學(xué)連接形式使用與末端半胱氨酸殘基反應的肽硫酯。

8.固相肽合成的一個(gè)例子

 

以下是使用堿不穩定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護基團在聚酰胺或聚苯乙烯樹(shù)脂上合成肽的合成步驟的概述。使用下面概述的技術(shù),將獲得在N-末端用乙?;舛?,在C-末端用伯酰胺(CONH2)封端的肽。

 

為手動(dòng)肽合成設置玻璃器皿

 

手動(dòng)肽合成可以在具有三通閥的燒結過(guò)濾器反應容器中完成,該三通閥通過(guò)1孔塞子安裝在1 L側臂真空燒瓶上。一個(gè)閥門(mén)用于充入氮氣,氮氣首先通過(guò)一個(gè)小的Drierite柱,然后進(jìn)入反應混合物以攪拌溶液和混合試劑。另一個(gè)閥門(mén)用于排空過(guò)量的反應溶液,并使用真空瓶洗滌溶劑。用于固相合成的所有玻璃片應在使用前用硅烷化試劑(如DCM中的1-5%二甲基二氯硅烷)處理,以避免靜電荷的積累,靜電荷的積累會(huì )使樹(shù)脂很難處理。

 

聚酰胺樹(shù)脂的制備

 

聚酰胺(PL-DMA)樹(shù)脂(1g)用乙二胺(40 ml)在50 ml Falcon管中在搖床上處理過(guò)夜,然后過(guò)濾,用5×10ml 1:1二甲基甲酰胺(DMF):二氯甲烷(DCM)溶液、5×10ml 1:1 DCM洗滌,并使用苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鹽(PyBOP) (3 eq)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBt) (3 eq)和二異丙基乙胺(DIPEA)裝載Fmoc-Rink然后可以在真空下干燥,并儲存在-15攝氏度,直到需要。

 

在合成前和合成過(guò)程中處理樹(shù)脂

 

樹(shù)脂首先在10毫升1∶1 DCM∶DMF中溶脹15分鐘,然后瀝干。每次完成氨基酸偶聯(lián)后,還用5×10ml 1:1 DCM和DMF洗滌樹(shù)脂。

 

Fmoc-去保護

每次氨基酸偶聯(lián)后,用2×10ml 20%哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc去保護,每次處理用N2攪拌10分鐘。然后用5×10毫升DMF洗滌樹(shù)脂,接著(zhù)用5×10毫升1:1 DCM:DMF洗滌。

 

添加氨基酸

 

為了在Fmoc-聚酰胺-Rink樹(shù)脂上開(kāi)始肽合成,通過(guò)用哌啶處理樹(shù)脂來(lái)除去Fmoc基團。然后使用在1∶1 DCM∶DMF中的PyBOP (3 eq)、HOBt (3 eq)和DIPEA (6 eq)將第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)至樹(shù)脂的Fmoc-去保護的N-末端胺,或之前偶聯(lián)的氨基酸,直到樹(shù)脂對茚三酮呈陰性。

 

監測氨基酸偶聯(lián)的進(jìn)展

 

氨基酸偶聯(lián)的過(guò)程可以用茚三酮或對氯醌來(lái)跟蹤。茚三酮溶液在游離伯胺的存在下變成深藍色(陽(yáng)性結果),但在其他情況下是無(wú)色的(陰性結果)。如果使用乙醛作為溶劑,在伯胺的存在下,或者如果使用丙酮,在仲胺的存在下,對-氯醌溶液將使樹(shù)脂珠變成深黑色或藍色;否則珠子保持無(wú)色或淡黃色。(測試概述如下)

 

茚三酮測試(1)

 

向微量離心管中加入2滴40%苯酚的乙醇溶液、2滴0.014 M KCN的吡啶溶液和4滴5%茚三酮的乙醇溶液,以及抹刀一端大小的樹(shù)脂樣品,然后渦旋混合物,并在100°c下加熱5分鐘

 

用氯醌測試(2)

 

向微量離心管中加入5滴丙酮或乙醛、5滴對氯醌的甲苯飽和溶液,以及小刮刀一端大小的樹(shù)脂樣品,然后渦旋混合物,并在室溫下靜置5分鐘。丙酮用于檢測仲胺,乙醛用于檢測伯胺。

 

持續肽延伸

 

一旦氨基酸的偶聯(lián)完成,就洗滌樹(shù)脂,用哌啶去保護Fmoc基團,并再次洗滌樹(shù)脂,為下一次偶聯(lián)做準備。重復這一過(guò)程,直到添加完所有必需的氨基酸。

 

乙?;疦-末端

 

肽序列完成后,可以用2ml 1:1乙酸酐和三乙胺在10ml 1:1 DCM:DMF中乙?;疦-末端胺1小時(shí)或直到茚三酮陰性,然后用5×10ml 1:1 DCM:DMF洗滌樹(shù)脂,然后將肽從樹(shù)脂上切下。如果需要,N-末端也可以作為游離胺留下。

 

從樹(shù)脂上切割肽

 

用3×10ml 96∶2∶2的TFA、三異丙基硅烷(TIPS)和水(H2O)處理樹(shù)脂,每次處理10分鐘,然后過(guò)濾掉樹(shù)脂,將合并的濾液靜置1小時(shí),以確保除去酸不穩定的保護基團。

 

從樹(shù)脂上切割后肽的處理

 

將TFA在旋轉蒸發(fā)器上蒸發(fā)至干(或重油或玻璃,如果它不凝固的話(huà)),隨后向燒瓶中加入5 ml*醚以沉淀肽,并除去大部分副產(chǎn)物。將肽和乙*的懸浮混合物加入到50 ml Falcon管中,并以3000 rpm的速度旋轉10-20分鐘(IEC離心機),直到可以倒出乙*而不損失任何肽。加入更多的后,通過(guò)渦旋使肽重新懸浮。再次離心混合物,倒出,洗滌過(guò)程重復兩次以上。最后,產(chǎn)品可以在脫粘器中的Falcon管中風(fēng)干過(guò)夜。

通常使用制備型HPLC來(lái)純化最終產(chǎn)物。獲得質(zhì)譜數據以確保獲得目標肽。



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