概述 - 定量“實(shí)時(shí)"PCR 或 qPCR

定量實(shí)時(shí) PCR 改變了我們測量核酸濃度的能力，并且是驗證微陣列分析和其他基因組技術(shù)生成的表達數據的重要一步。實(shí)時(shí) qPCR 儀器的開(kāi)發(fā)促進(jìn)了這一點(diǎn)，該儀器可測量反應每個(gè)步驟或“實(shí)時(shí)"產(chǎn)生的 qPCR 產(chǎn)物的量。 SYBR green 因其相對簡(jiǎn)單和可靠而成為目前流行的實(shí)時(shí) PCR 方法。在實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)發(fā)展之前，定量測量需要設置多個(gè) PCR 反應，以便在擴增的線(xiàn)性階段捕獲 qPCR 產(chǎn)物。然后通過(guò)凝膠電泳或 HPLC 進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物的分離和定量。這些實(shí)驗非常費力，并且實(shí)現正確定量所需的操作次數增加了引入錯誤的可能性。因此，能夠在每個(gè)熱循環(huán)測量 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí) PCR 儀器的開(kāi)發(fā)提高了定量 PCR 的簡(jiǎn)便性、準確性和重現性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現，出現了多種應用。其中包括 1) 通過(guò)微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。實(shí)時(shí) PCR 儀器的開(kāi)發(fā)可以在每個(gè)熱循環(huán)中測量 PCR 產(chǎn)物，從而提高了定量 PCR 的簡(jiǎn)便性、準確性和重現性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現，出現了多種應用。其中包括 1) 通過(guò)微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。實(shí)時(shí) PCR 儀器的開(kāi)發(fā)可以在每個(gè)熱循環(huán)中測量 PCR 產(chǎn)物，從而提高了定量 PCR 的簡(jiǎn)便性、準確性和重現性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現，出現了多種應用。其中包括 1) 通過(guò)微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。其中包括 1) 通過(guò)微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。其中包括 1) 通過(guò)微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達數據的驗證，2) DNA 拷貝數的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達。

一般來(lái)說(shuō)，實(shí)時(shí) PCR 方案與標準 PCR 反應類(lèi)似。同樣的問(wèn)題也適用于生產(chǎn)干凈的模板、設計引物和優(yōu)化反應條件。主要區別在于加入了 SYBR green 等嵌入劑或使用熒光引物來(lái)檢測 PCR 產(chǎn)物。在典型的反應中，qPCR 產(chǎn)物的產(chǎn)生呈指數級增長(cháng)。由于需要幾個(gè)循環(huán)才能輕松檢測到足夠的產(chǎn)物，因此熒光與循環(huán)數的圖呈現 S 形外觀(guān)。在稍后的循環(huán)中，反應底物耗盡，qPCR 產(chǎn)物不再加倍，并且曲線(xiàn)開(kāi)始變平。曲線(xiàn)上熒光量開(kāi)始快速增加的點(diǎn)，通常比基線(xiàn)高幾個(gè)標準差，稱(chēng)為閾值循環(huán)（Ct 值）。 Ct 與模板的關(guān)系圖是線(xiàn)性的，因此比較多個(gè)反應之間的 Ct 值可以計算出目標核酸的濃度。這條線(xiàn)的斜率提供了 qPCR 效率的衡量標準。

PCR產(chǎn)物可通過(guò)生成標準曲線(xiàn)來(lái)定量或相對于對照基因進(jìn)行定量?；跇藴是€(xiàn)的實(shí)時(shí)PCR定量可以利用質(zhì)粒DNA或其他形式的DNA，其中每個(gè)標準的絕對濃度是已知的。然而，必須確保標準品的 PCR 效率與“未知"樣品的 PCR 效率相同。在某些情況下，從純化的靶標中進(jìn)行 PCR 比用復雜的核酸混合物觀(guān)察到的效率更高。相對定量方法稍微簡(jiǎn)單一些，因為它需要測量管家或對照基因以使目標基因的表達標準化。然而，選擇適當的控制基因可能會(huì )引起問(wèn)題，因為它們不一定在所有未知樣本中均等表達。這可以通過(guò)對一組管家基因進(jìn)行標準化測量來(lái)避免，以避免這種變異性問(wèn)題。

進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 的一個(gè)關(guān)鍵方面是從高純度的模板開(kāi)始。在處理某些生物樣品時(shí)，這可能具有挑戰性。幸運的是，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多商業(yè)產(chǎn)品來(lái)促進(jìn)高純度核酸的分離。去除污染性苯酚和不需要的 DNA 是需要考慮的步驟。對于基因表達研究，必須使用高純度試劑并多次重復進(jìn)行逆轉錄，因為此步驟可能會(huì )引入模板復制的變異性。逆轉錄可以在實(shí)時(shí)PCR之前進(jìn)行，或者可以并入擴增程序中。

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